Detection of human prions in bodily fluids and peripheral tissues

Las enfermedades priónicas son enfermedades neurodegenerativas fatales e infecciosas que afectan a humanos y otros mamíferos. Los priones son los biomarcadores más confiables y el agente infeccioso más probable de causar estas enfermedades. De acuerdo con la hipótesis solo-proteína, priones están formados por una versión aberrantemente plegada y patogénica (PrPSc) de la proteína prion que está presente normalmente y es innocua (PrPC). PrPSc interactúa con PrPC e induce el cambio de conformación al estado patogénico, generando más PrPSc que se acumula en el sistema nervioso central produciendo acumulación de priones y daño espongiforme, que son marcas distintivas de las enfermedades priónicas.
En humanos, Creutzfeldt-Jakob disease esporádico (sCJD) es la enfermedad prionica más común, representando alrededor del 85% de los casos. Esta enfermedad se ha transmitido entre humanos iatrogénicamente, debido a cirugías y tratamientos con hormonas purificadas de cerebro. En los 90 apareció una nueva variante de Creutzfeldt-Jakob disease (vCJD), debido a la transmisión inter-especie de priones de vacuno afectado por encefalopatía espongiforme bovina (BSE), potencialmente por ruta oral. Desafortunadamente, vCJD se ha transmitido en humanos a través de transfusión sanguínea. Aunque no hay reporte de transmisión a través de procedimientos quirúrgicos, la presencia de priones en el sistema linfático ha causado alarma en salud pública. Hasta ahora, no hay cura ni método de diagnóstico aprobado por agencias de salud gubernamental contra estas enfermedades.
En esta tesis, se ha desarrollado un método de diagnóstico para la detección de priones en sangre y orina de pacientes con vCJD. Esta técnica llamada Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA) toma ventaja de la capacidad auto-replicativa de los priones para amplificar la pequeñísimas cantidades de priones en una muestra y hacerlos detectable por métodos bioquímicos estándar, como western blot. Nuestros resultados muestran por primera vez la presencia de priones en orina en de pacientes con vCJD, mientras que establecemos la presencia de priones en sangre como como un biomarcador de la enfermedad. El potencial de diagnóstico de PMCA para la detección de priones en sangre es demostrada con la sensitividad y especificidad de 100% alcanzada. Además, analizamos muestras de sangre de macacos experimentalmente infectados con vCJD. Estas muestras fueron colectadas durante las etapas clínica y preclínica de la enfermedad, y fueron analizadas en estudios simple ciego. Para analizar estas muestras, re-estandarizamos PMCA para la amplificación de priones de macaco, lo que nos permitió detector priones en sangre más de 750 días antes de los primeros síntomas de la enfermedad.
PMCA también fue usada para determinar la distribución de priones auto-replicativos en tejidos periféricos además del sistema linfático, lo que no ha sido descrito hasta el momento para pacientes con vCJD. Sorprendentemente, priones auto-replicativos fueron encontrados en todos los tejidos analizados, muchos de los cuales nunca han sido propuestos como reservorio de priones. Nuestros resultados muestran una distribución sistémica de priones en el cuerpo, lo que es relevante en términos de salud pública y para el desarrollo de tratamientos anti-prion.
Dado que priones asociados a sCJD no se auto-propagan bajo las mismas condiciones de PMCA que los priones de vCJD, nosotros también intentamos estandarizar condiciones de PMCA para la amplificación eficiente de priones sCJD. Una herramienta así sería muy útil para el desarrollo de métodos de diagnóstico altamente sensibles y específicos, además del estudio de la biología básica de los priones de sCJD. A pesar de que pudimos lograr tasas de amplificación mayor a lo reportado en la literatura, la eficiencia no es suficiente para intentar la detección de priones en muestras de sangre, orina o tejidos periféricos de pacientes con sCJD.