Enos en neuronas regula la activación del factor de transcripción Nf-Kb y la expresión de sus genes blanco

Muchas enfermedades del sistema nervioso central, incluyendo los trastornos neurodegenerativos, están asociados a la excitotoxicidad neuronal, un tipo de muerte neuronal inducida por la excesiva activación de los receptores de glutamato principalmente del tipo N-metil-D-Aspartato (R-NMDA). Se gatilla así un ingreso masivo de Ca2+, siendo éste el principal inductor del proceso excitotóxico, ya que lleva a la activación de una serie de vías que conducen a la muerte neuronal. Una de las vías que favorece la excitotoxicidad neuronal es la activación del factor transcripcional NF-B, un heterodímero compuesto principalmente por las subunidades p50 y p65. NF-B interactúa con el promotor y/o regiones enhancers en las regiones regulatorias de gene blancos, controlando así la transcripción de múltiples genes. Normalmente, el dímero p50/p65 se encuentra inactivo en el citoplasma, secuestrado por la proteína inhibitoria IB que enmascara su señal de localización nuclear. NF-B se puede activar por una amplia variedad de estímulos que llevan a la fosforilación de la proteína IB, induciendo la liberación del dímero p50/p65, pudiendo ahora translocar al núcleo. La actividad de NF-B es regulada por múltiples vías de señalización inter-relacionadas que son gatilladas en diferentes contextos fisiológicos. Así, NF-B está sujeto a complejas combinaciones de modificaciones post-traduccionales que son determinantes para la transcripción de genes blanco, por lo que la activación de NF-B por distintas vías puede llevar a la expresión de genes muy diferentes, por ejemplo, implicados en neuroprotección versus neurotoxicidad. No se comprende del todo cómo las modificaciones post-traduccionales, como fosforilaciones, metilaciones, S-nitrosilaciones o acetilaciones, actúan para permitir la transcripción de un grupo determinado de genes. En particular se ha visto que la S-nitrosilación juega un papel determinante en la expresión de 16 genes dependiente de NF-B, ya que obstaculizaría la unión a sus secuencias en el DNA, resultando en la inhibición de su actividad transcripcional. Nosotros implementamos un modelo de excitotoxicidad neuronal en cultivos primarios, en donde las neuronas de hipocampo son sensibles a la muerte neuronal inducida por NMDA, a diferencia de las neuronas de corteza que son resistentes a este estímulo. Además, y muy importante, hemos observado que la subunidad p65 aumenta su S-nitrosilación en neuronas de corteza después de estimulación con NMDA, lo que se correlaciona con neuroprotección, en cambio en neuronas de hipocampo disminuye la S-nitrosilación, que se correlaciona con neurotoxicidad. La S-nitrosilación de proteínas requiere de síntesis de óxido nítrico (NO), catalizado por las enzimas óxido nítrico sintasas (NOS). Hasta ahora, se asumía que en el SNC el NO es sintetizado por la enzima óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS). Sin embrago, datos preliminares del laboratorio mostraron que la isoforma endotelial (eNOS) estaría localizada en neuronas en cultivo primarios, donde podría constituir una fuente de NO implicada en la S-nitrosilación neuroprotectora de p65 y en la regulación de su actividad transcripcional. Basados en estos antecedentes, se postuló la hipótesis que: “El NO producido por eNOS en neuronas induce la S-nitrosilación de p65, regulando su actividad transcripcional en condiciones de excitotoxicidad”.
Utilizando distintos tipos de microscopía y RT-qPCR corroboramos la presencia de eNOS en cultivos de neuronas. Además, determinamos que eNOS tiene una localización principalmente postsináptica y en balsas lipídicas. Mediante estrategias de interferencia (shRNA) validamos la presencia de eNOS y su función en la producción de NO, además demostramos que eNOS induce la S-nitrosilación de NF-B y otras proteínas tanto en cultivos primarios de corteza como de hipocampo. En condiciones de excitotoxicidad inducida por NMDA en cultivos de hipocampo, detectamos un aumento en la traslocación nuclear de p65 y aumento en la actividad transcripcional de NF-B, además de un aumento 17 en la expresión del mRNA de la citoquina pro-inflamatoria IL-1β. Por el contrario, en cultivos de corteza no detectamos ningún tipo de cambio. Inhibiendo farmacológicamente la producción de NO en condiciones excitotóxicas, no se observó ningún tipo de modulación de NF-B en cultivos de hipocampo, no obstante, en cultivos de corteza observamos un aumento en la actividad transcripcional de NF-B. Posteriormente al añadir un dador de NO en cultivos de hipocampo estimulados con NMDA, observamos que disminuyó la actividad transcripcional de NF-B y la expresión del mRNA de IL-1β, mostrando que se puede modular la actividad transcripcional de NF-B y la expresión de sus genes por S- nitrosilación. Por primera vez se muestra que eNOS participa en la S-nitrosliación de proteínas en neuronas. Más aún, nuestros resultados permiten avanzar en el conocimiento de mecanismos celulares implicados en la regulación de la actividad transcripcional de NF-B por S-nitrosilación en condiciones de excitotoxicidad, lo que podría ayudar en la identificación de nuevas estrategias terapéuticas para la prevención de la muerte neuronal asociada a trastornos neurodegenerativos.